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标题: 学习笔记：初步判断PDB上X-ray结构模型中特定残基/配体结构可信度的方法 [打印本页]

作者
Author: student0618 时间: 2024-12-3 19:56
标题: 学习笔记：初步判断PDB上X-ray结构模型中特定残基/配体结构可信度的方法
本帖最后由 student0618 于 2024-12-4 09:10 编辑

0. 前言
作蛋白质模拟时经常会从公开的资料库PDB下载structural model 作初始结构。然而，PDB上的结构质素参差不齐。特别是有小分子结合的结构，作蛋白晶体的老师们不论是来自国内还是国外都很常把一句「PDB很多结构根本没小分子在，就硬是放进去」挂在嘴边。因此，判断一个在PDB上的蛋白-配体结构是否能放心使用对后续模拟十分重要。

刚开始和一位实验组老师合作时，我不小心选了个「这种质素居然能发Nature/Science/Cell/PNAS......」的结构而被训了。于是，老师教了我用pdb上该结构的structure factor mtz文件初步判断PDB中配体是否在、pdb原始文献的论点是否言过其实的方法。虽然PDB网站可以用内建的Mol* viewer看electron density map，但这个map是有model bias 的，可能会有误导性。而结构的原始文献通常都会给没有model bias的omit map图，但作者可以很有技巧地调map 的contour level 把noise当作该残基/配体的electron density，误导读者或者是pdb的用家。因此，较理想的方法是快速自己算一下该配体/残基的omit map来检查。在此分享一下我的学习笔记，希望可以帮助到有需要的同学们。

(注：以下适用于X-ray晶体结构模型，不是cryo-EM的模型。)

一、Software 软件

Phenix (需注册)

网址为 https://phenix-online.org/
原生Windows 版本较新版本可能用不了，打开就闪退。我目前是在Windows 10 用原生1.20.4487版。官方建议用WSL2 装linux版以使用所有功能，也可以试试。
Mac需要有XQuartz，也很可能会遇到python bug。搜官方mailing list 安装bugfix 再按指示装那补丁即可。
Linux版本安装简单直接，Centos 7 和linux mint 19 都没什么问题。

(Alternative: CCP4 也可以。除了那个5GB的包外，也有云端版本不必在本地安装，注册后登入就能用。不过我不太熟悉CCP4，先跳过了。而且他的服务器大概还在完善中，可能不大稳定。先前参加CCP4开发者主持的工作坊，30多人同时交refinement作业时server没了。)

Coot/WinCoot

Mac/Linux的coot下载网址爲https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Windows 的WinCoot下载网址为 https://bernhardcl.github.io/coot/wincoot-download.html
Mac版本如果用MacPort、Home Brew 各种方法都不行，可安装CCP4用他自带的Coot。

二、 Workflow操作流程

没装到软件或只用手机的话：
可以先用PDB网站看看density map。如果有红色density 和配体/残基的原子重叠这模型是有问题的。就算没重叠，如果蓝色的map包不住整个分子/残基也是有点可疑的，要小心，未必能尽信。

Phenix+coot/wincoot可用的话：

从PDB下载结构的pdb文件和mtz (2024年12月补记：现在PDB好像不能直接下载mtz了，可参考https://www.rcsb.org/docs/genera ... ectron-density-maps 如何把pdb上的structure factor cif 换成mtz)
複製一遍pdb文件，新的文件用喜欢的任何方法删除目标的配体/残基。
Phenix开新project，随便给个名字， set好working directory。
右方选单选Phenix.refine，弹出的视窗选删除了目标配体/残基的pdb文件和mtz文件。
跑一遍refinement，只是要快速测一遍的话用预设参数就可以。
打开Coot或WinCoot，左上file - opem coordinates，选下载的(没删配体/残基的)pdb文件。
Coot左上file - auto open mtz，选phenix 生成的mtz
目标是小分子配体的话：Coot上方第二栏有个2D小分子的图示，按下去就可以快速找到小分子。
目标是特定残基的话：按绿色箭头指着黄色圆形的图示，输入编号或者在残基选单找。
Coot display 上方有小字标 “map (数字) level = ...”，那个是density map的contour level，可用滑鼠滚轮调整。蓝色的2fo-fc map调1 rmsd，红/绿色的fo-fc map/difference map调3 rmsd (注：display manager选择调整哪个map)。
检查目标配体/残基是否完整被绿色的Map包裹。不行的可调小一点fo-fc map, 但最好不要低于2 rmsd。
想试玩一下的可以自己试试Fit那目标再跑一遍refinement，看看例如R-free能不能做得比PDB好。做法的话偏离了这帖主题了，可参考Phenix官方的保姆级超仔细教程。

三、总结
本帖总结了一下如何初步判断PDB上晶体结构模型可信度的步骤。要选pdb作模拟的初始结构或者是experimental reference for model validation的话可以先用这方法检查一下。这只是个快速测一下的方法，正式算文献中的omit map会用更专门的工具(phenix选单可以找到正式omit map的工具)

作structure determination的老师很强调PDB上那些原子座标是是structural model不是实际structure，使用时要小心注意。其他判断方法除了PDB给的validation report外还有例如看resolution高低、检查R-free值是否和同resolution的结构相近、配体的B-factor是否在蛋白平均B-factor的两倍范围内等。还在学习中怕写错，就先不详细描述了。

四、延伸阅读

Phenix手册 https://phenix-online.org/documentation/ ，有兴趣体验解crystal structure可试试step-by-step tutorial 5 (https://phenix-online.org/documentation/tutorials/mr_refine.html)
新手向背景理论书籍 Crystallography Made Crystal Clear: A Guide for Users of Macromolecular Models 作者：Gale Rhodes

五、备注

习惯用英文写学习相关的文章，中文还在练习。若有翻译错误或不通顺之处还请不吝赐教。
X-ray diffraction相关内容我刚开始学习，只了解一点点皮毛。如有错漏或补充也请指正。
目前在国外参加会议，笔电不幸出了点意外，因此没有截图可贴。先贴文字，能救回来有时间再补图。

作者
Author: HNUST 时间: 2024-12-3 20:58
我确实从来没有考虑过X-ray结构的合理性，不过通常我会看解析PDB的那一篇文章。如果PDB确实找不到结构完整的（缺少辅因子、配体），我会找同源且含有辅因子、配体的结构，将蛋白质准备一下（修复结构、能量最小化之类的），根据结合口袋进行对齐，二者叠合的同时去除模板蛋白。就是相当于把同源蛋白中辅因子、配体转移到我需的蛋白上面，最后再refine。我这种方式可行吗？此外我还尝试用AF3增加辅因子。

作者
Author: HNUST 时间: 2024-12-3 21:04
而且我遇到过一种情况。就是某些蛋白如果加入辅因子就完全无法结晶，所以必须要用特殊手段加入。结构原始文件的作者在文章中是建议找一个同工酶，二者结合口袋叠合一下

作者
Author: student0618 时间: 2024-12-3 21:25
本帖最后由 student0618 于 2024-12-3 21:26 编辑

HNUST 发表于 2024-12-3 20:58
我确实从来没有考虑过X-ray结构的合理性，不过通常我会看解析PDB的那一篇文章。如果PDB确实找不到结构完整 ...

我这份笔记是判断pdb给的结构是否可信、该PDB entry的文献指“根据我们的晶体结构可以下这个结论”是否言过其实哦。

如果是诚实的作者如实指出晶体里面没有配体或辅因子，而我们要模拟有这些的情况下，通常也是如HNUST您所说从其他途径取得，例如用相近又有该配体的pdb align好合上去跑MD refine一下、或是docking候对比一下相近结构、蛋白不完整的话用例如modeller补等等。

作者
Author: SiqiLee 时间: 2024-12-12 09:37
好奇，不是做结构的，这个方法对X-ray可以判断，但是为什么对cryo-EM的模型不可以呢？

作者
Author: student0618 时间: 2024-12-12 12:01

SiqiLee 发表于 2024-12-12 09:37
好奇，不是做结构的，这个方法对X-ray可以判断，但是为什么对cryo-EM的模型不可以呢？

我也还在学习中。以下是我的理解，有误请指正。

X-ray diffraction 的density map 是算出来“目的为最贴近实验数据的”，因此和实验数据不合的地方可以从difference map看到。

Cryo-EM 的density map 是用“拍电影”的方式从超高清二维影像构建的三维density map，因此可说是个“三维影像”。

作者
Author: SiqiLee 时间: 2024-12-12 19:11

student0618 发表于 2024-12-12 12:01
我也还在学习中。以下是我的理解，有误请指正。

X-ray diffraction 的density map 是算出来“目的为最 ...

谢谢解答！

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